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          熒光光譜測量解決方案

          熒光光譜測量解決方案

          本文關鍵詞: 生物醫藥新材料熒光
          摘要

          激發光與物質作用,產生與激發光不同波長、或者不同頻率的光,這就是熒光。當一個短波長的激發光在一點激發物質,我們就能在物質發散的其他位置觀察到比激發光更長波長的光。

          當某種物質經某種波長的入射光(通常是紫外線或X射線)照射,吸收光能后進入激發態,并且立即退激發并發出比入射光的的波長長的出射光(通常波長在可見光波段);而且一旦停止入射光,發光現象也隨之立即消失。

          光照射到某些原子時,光的能量使原子核周圍的一些電子由原來的軌道躍遷到了能量更高的軌道,即從基態躍遷到第一激發單線態或第二激發單線態等。第一激發單線態或第二激發單線態等是不穩定的,所以會恢復基態,當電子由第一激發單線態恢復到基態時,能量會以光的形式釋放,所以產生熒光。

          熒光測量

          熒光激發光譜可以通過有效的熒光激發波長來展示,并能看出熒光轉化效率。大多數情況下,激發波長和物質的發射波長會發生重疊,但是如果非常了解熒光機理,不難判斷出長波為熒光發射波長,短波段為激發波。

          熒光光譜

          圖1. 激發波長和發射波長重疊現象

          模塊化光譜儀,激發光源和其他附件的搭配,可以使客戶自由根據自己的需求搭配適合參數的熒光測量系統,同時海洋光學提供的配件可以輕松讓客戶在吸光度和熒光測量間隨意切換,模塊化光譜儀的多樣應用和優越性完美體現。

          光譜儀

          QE pro

          圖2. 高靈敏度,背照減薄型CCD光纖光譜儀

          鑒于熒光的特性,海洋光學提供高靈敏度光譜儀Maya2000 proQEPro系列供熒光檢測使用,兩者檢測器同為背照減薄型CCD,QEPro還帶有CCD制冷,所以信噪比上更具有優越性。

          海洋光學提供的熒光和吸光度模塊化測量系統,非常便于在吸光度和熒光測量之間進行切換,客戶只需要將光纖和比色皿支架的連接位置進行更改,就可以實現兩種不同原理的測量。下圖為吸光度測量的典型配置方案,客戶可以根據自身的需求選擇不同模塊的光譜儀,高靈敏度的Qepro,高性價比的Flame系列,而且光譜儀的可更換狹縫還可以根據客戶的需求自行更換(吸光度測量可以使用小狹縫的光譜儀,熒光相對于是比較弱的發射光,可以選擇使用更大狹縫的光譜儀)。?

          另外,模塊化的光譜儀更易根據客戶的需求更改激發光源,激光器或者LED都可以。如果使連續光源,客戶可以使用濾光片將連續光源過濾成單色光進行熒光測量,具體型號可以參考圖3。

          ?為了判定未知熒光物質的激發波長,我們推薦客戶先選擇使用可自行更換狹縫的QE Pro-ABS光譜儀(也可以使用Flame系列光譜儀)。

          ?比色皿支架也可以先選擇CUV-ALL-UV四通道的支架,180°的連接可以實現吸光度測量,90°的連接可以進行熒光測量。CUV -ALL-UV內置了濾光片卡槽,客戶可以自行將濾光片調節好后放置到比色皿支架上,實現吸光度裝置完成熒光測量。另外,客戶也可以將連續光譜光源更換成LED光源(比如LLS-365,LLS-470)。

          吸光度/熒光測量系統

           吸光度/熒光測量系統
          光譜儀QE Pro-ABS高靈敏度光譜儀(200-950nm)
          光源/激發光源?LLS-365 and LLS-470 LEDs for excitation LLS-365/LLS-470LED激發光源
          光纖/探頭:QP600-2-VIS-NIR 光纖,兩根
          附件CUV-ALL-UV比色皿支架,另加74-MSP反射鏡
           INTSMA-200可更換狹縫;LVF-KIT濾光片套件
          軟件OceanView操作軟件
          樣品未知熒光物質

          激發光源

          激發光源的選擇很多樣,比如LED光源、激光等等。如果您選擇使用LED,那LED的中心波長最好接近激發光源波長;如果您選擇激光,激光的強度最好要能被光譜儀檢測到,才能保證發射熒光能被檢測到。如果選擇使用帶寬光源(即連續光譜光源)作為激發光,我們可以使用單色濾光片濾出單色光。

          盡管熒光物質的激發波長與其吸收波長不一致,但是一般情形下我們可以通過簡單的吸光度測試來判斷熒光物質的激發波長。當我們對比吸光度光譜和發射光譜時,大多數情況下還是很類似的,只是相對強度會有差異。

          可選濾光片

          帶通濾光片是窄化激發光源的最簡單選擇,該濾光片由長通和短通兩塊濾光片組成,通過調節短通濾光片的位置,可以實現單色激發光。

          濾光片

          圖3 可調中心波長線性帶通濾光片

          如果未知熒光物質的激發波長,我們推薦客戶使用可調線性濾光片,比如海洋光學的產品LVF-HL,客戶可以自行通過調節濾光片找到最適合的激發波長??烧{式的帶通濾光片,可以設置帶寬20nm到100nm不等的單色波,還可以單獨使用長通和短通濾光片,設置起始波長和截止波長。

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          采樣附件

          標準熒光測試系統采用與激發光90°角的位置接收熒光,這樣的收光方式最大程度上減小了透射光與散射光的影響。

          模塊化的熒光測量系統最大的優點在于在使用單個激發光源和檢測器的情況下,它能最快、最簡單地、最快速遞獲得即時數據。通過改變光纖的連接位置,可以實現0°, 90°和180°的不同收光角度,從而對樣品進行不同形式的光學測量。另外,我們還可以選擇可浸入式的探頭,或者可調節帶寬光學濾光片,針對不同的應用環境進行熒光測試。下面就介紹一下海洋光學可提供的配件選擇:

          CUV-ALL-UV

          圖4:配有準直透鏡的比色皿卡槽(CUV-ALL-UV),可實現90°的熒光測量和透過型吸光度測量

          CUV-ALL-UV比色皿卡槽,更換其中的透鏡為74-MSP可以提高樣品熒光的聚集。另外使用Fluoro Vettes比色皿,由于其在紫外段的極好透過率和其微量(50uL)容積,可以簡便高效率地實現nmol濃度物質的熒光測量。

          CUV-FL-DA配有海洋光學的光源和 4通道的比色皿卡槽,由于其不使用光纖耦合而是空間耦合的方式,大大提高了耦合效率。

          如果需要測量高濃度的液體樣品、固體或者粉末,熒光反射探頭是比較理想的選擇。使用熒光反射探頭,可以直接接觸樣品表面,獲取樣品的熒光散射光。另外可以通過使用濾光片過濾激發光,使熒光散射光譜更明顯 。

          對流動的樣品進行熒光測量,可以使用熒光測試流通池,可以隨時監控熒光樣品的反應過程及整個狀態。

          實驗

          ?為了確定樣品的確定激發波長,我們可以先對樣品進行吸光度測量。使用QE Pro-ABS,比色皿支架和鹵鎢燈。QE Pro-ABS使用10um狹縫配置,非常適合于吸光度測量。使用OceanView的吸光度操作包,完成簡單的吸光度測量。


          OceanView的吸光度操作包

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          一旦你獲得了未知熒光物質的吸光度光譜,我們就能判斷該物質的激發波長大概的范圍,從而判斷該物質產生熒光的最有效激發波長,再去購買最合適的LED激發光源。

          熒光測量搭建圖

          上圖為典型的熒光測量搭建圖,四通道的CUV-ALL-UV可以根據測試需求自行更改。吸光度測量時,可以在180°位置使用兩個74-UV(準直鏡);熒光測量時,90°位置使用兩個74-UV,另外另個通道使用74-MSP反射鏡,增加可接收的熒光信號。

          軟件的使用

          新版OceanView軟件可以讓使用者更好地使用光譜儀進行各種應用。當使用OceanView進行熒光測量時,經常使用到兩種測量模式:QuickView mode(快速掃描)和Relative Irradiance mode(相對輻射)。

          快速掃描模式可以顯示每個像素點的原始光強,而不進行任何處理步驟或者光譜儀強度校準等。我們需要銘記的是,由于每臺光譜儀的單個原件和檢測器的不一樣,導致每臺光譜意義的感光強度也就不一樣,所以使用者容易被快速掃描模式誤導,發現顯示的光譜數據與理論數據(參考論文文獻等的數據)有差,特別是光譜形狀和中心波長等等,所以這時候就需要使用相對輻射或者絕對輻射模式。

          相對輻射模式下,儀器的響應可以通過已知色溫值的標準光源在進行標定,鹵鎢燈作為一種典型的已知色溫值的標準光源,可以用于可見到近紅外波長范圍。相對輻射測量能對光譜儀進行相對強度校準。

          但是相對輻射校準能滿足于熒光測量嗎?并不是 。使用單個光譜儀進行測量是相對精確的,您可以對熒光發射峰與其他峰的比值進行計算,從而得出相對比較準確的熒光強度數值。

          當我們使用不同光譜儀進行熒光測量時,使用相對輻射是非常重要的,通過相對輻射測量可以判斷光譜形狀,光譜的位置及偏移等等。

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          總結

          傳統的熒光測量系統相對比較不靈活,也比較局限于實驗室使用。而模塊化的光譜儀能靈活應用于熒光測量,選配不同的附件和采樣裝置,能實現多種搭配,這些是傳統熒光測量系統不能比的。

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